受精作用

1. sex: 親代基因的結合。

2. reproduction:新個體的產生。

以下是受精作用主要的4個重要階段:

1.  精子和卵子之間如何接觸和認定-- 種的十專一性;

2. 精子進入卵子的調控, 以防止"polyspermy";

3. 精子和卵子之間遺傳物質的結合,細胞核的fusion;

4. 卵內機制的活化而造成發育的開始。

   首先簡單介紹哺乳動物精子的結構:圖中的flagellum是從centriole生成,而centriole 進入卵之後就成為centrosome,可知之後的centrosome  是來自父系; 而大部份mitochondria 之後都不會進入卵子; 另外 acrosomal vesicle 含大量enzyme可幫助精子進入卵子; axoneme是主要的motor,外包有fiber。

      例如哺乳動物精子的運動裝置(motile apparatus):是9+2 microtubules 的結構,而外面9 個microtubule doublet 都是由A, B 兩subunits 所形成,而dynein 則具有ATPase的活性可提供能量讓尾巴游動,還有外面那層fiber主要為穩定整結構; 男性的不育症其中為dynein不能起ATPase的活性。

本章節主要以sea urchin作為研究對象,優點為:結構簡以體外受精,隨處可見,四季可成熟。

以下的是sea urchin的卵子為例:

Vitelline envelope: sperm & egg間的species-specific。

Jelly layer: glycoprotein所組成,吸引和活化sperm。

Cortical granule:有如sperm的acrosome。

Cell membrance:此一層才是卵子的membrance。

a) EM圖  b)transmission EM圖

以哺乳類的hamster egg為例:

Oocyte vs. ovum

ooctye:未成熟的卵子

ovum: 成熟後的卵子

Cumulus:提供卵子的養份和保護

Zona pellucida:sperm binding receptor所在的位置

比較哺乳動物mouse和sea urchin兩個不同的受精過程:

a圖的第2點和b圖的第3點相同,而a圖的第4點和b圖的第2點相同。Sea urchin的精子先進行acrosome reaction,釋放出大量的enzyme,binding to vitelline envelope,進行recogition。而哺乳動物的次序則剛好相反,是先recogition,才acrosome reaction。

sperm & egg之間的species-speciality是sperm受egg發出的一種chemotaxis所吸引過去。如以sea urchin為例, resact是吸引sperm的主要物質。以下的實驗中以加入resact,可看到精子被吸引過去。

Acrosome reaction:

其中以sea urchin和hamster為例。

Sea urchin:

Bindin:用來與卵子jelly layer上的receptor作出recogition。於acrosome reaction前, 位於精子的acrosomal membrane內,但於acrosome reaction後會變成位於acrosomal process最表層。

當acrosome reaction發生時是sperm的表面的sperm cell membrane與acrosomal membrane fusion而把位於acrosomal membrane中的acrosomal enzymes釋放出來。

Hamster sperm:

        Binding protein本身位於membrane上,而且acrosome reaction是於sperm bind在egg上之後才發生的。

       精子本身並不是於開始的時候就可以有活性,需要有某些物質來把精子活化, 此一活化的過程為Capacitation。而於in vito的情況下來達至capacitation,其culture medium中必須加有Ca2+, HCO3-, albumin, 或是可以以oviduct fluid來培養。以下的圖是hypothetical來表現出哺乳動物精子capacitation的情況。由此可以知道為什麼於culture medium中必須加有Ca2+, HCO3-, albumin。

Species-specific間的bind是十分重要的, 尤其是體外受精的動物,所以sperm與egg間的interaction非常重要。下圖以sea urchin為例,實驗中利用兩種不同種的sea urchin的binding-protein-Bindin為例,不同種的生物之間存在specific-binding。

          於卵上的bindin receptors是有一定的數量的限制,如以下的實驗中可以証明: sperm並不是滿佈於egg的表面上,仍是會有空隙的存在,由此可以知道於egg表面上的bindin receptors是有一定數量於vitelline envelope。

         在哺乳動物中的Zona pellucida的功能就等於在無脊椎動物體內的 vitelline envelope,是由ZP1, ZP2, ZP3三種glycoproteins 組成,而下圖為以inhibition assay 的方法去證明ZP3為與精子結合的protein. 這堛磳雂F由於ZP3的加入,使精子與zona pellucida 結合明顯下降,而加入ZP1, ZP2就沒有什麼影響,另外,加入被切去醣的ZP3比正常的ZP3與精子結合效果差,可見醣與精子結合非常重要,也是防止polyspermy 的重要機制。

        在scanning electron micrographs下比較精子與卵子結合的方式,海膽的精子頂端接觸,垂直插入; 而hamster的精子則以平行切V插入。

        當發生 “polyspermy” 的情況時,由於染色體分佈不均,有些可能有過多有些則缺乏,當細胞分裂到一定數量時,就無法正常整合而造成死亡; 所以防止polyspermy是非常重要的。為了要防止polyspermy, 以海膽為例就發展出兩種防止機制; 一為 “fast block of polyspermy” 另一為 “slow block to polyspermy”

         Fast block 是在卵子與精子結合後1-3秒內細胞膜的電位從-70mV上升到約+20mV,這是透過增加細胞內鈉離子,但由於不能維持長時間,也不能F對防止另一精子進入,所以接下來在一分鐘之內就要進行 “slow block” 。上圖顯示出精子進入卵子後細胞膜電位的改變和鈉離子濃度與polyspermy的關係,可見鈉離子濃度對防止polyspermy非常重要。

        在精子進入後20秒開始,1分鐘內結束,位置為精子進入的地方,就進行slow block,主要是經cortical granule reaction釋出enzyme把vitelline envelope去除而使其他精子沒有任何機會進入受精卵,這過程可分4階段: 1先放出一種trpsin-like protease---cortical granule serine protease去溶解vitelline envelope 與細胞膜之間連結的protein; 2.再放出mucopolysaccharides 使滲透壓上升,而水份進入填補所有vitelline envelope 與細胞膜的空隙,使envelope 展開形成fertilization envelope; 3. 接下來放出peroxidase enzyme去強化fertilization envelope和把其他精子推開; 4. 最後放出一系列proteins,主要包括hyalin作為支持blastomeres的分裂。

        總括來說,當受精的一開始,卵子中的作用機制便會開始啟動,以sea urchin為例,此時的機制分別是由兩方面開始進行的,較早完成的一方是early responses,此時主要的作用為增加Na+進入卵中,以改變卵膜表面的電位為正極,以防止polyspermy,維持的時間約1分鐘左右; 而較晚完成的一方剛稱為late responses, 此時卵中的Ca2+的濃度從受精的點開始由0.1μM升至1μM,直至整個卵子,以Ca2+作為其後反應的signal,而Ca2+是於卵子中cortical granule旁的endoplasmic reticulum所分泌的,當Ca2+的濃度升高後,之後的一連串反應便發生,其中一個反應是cortical granule,此亦是用作防止polyspermy,約於1分鐘左右完成。

此圖可以說明sea urchin的Ca2+濃度於受精點開始濃度升高,其中Ca2+是以螢光的方法染色:

以sea urchin為例,其中以osmiun-zinc iodide染色的endoplasmic reticulum和以螢光染色的Ca2+是於卵子的位置一樣:

此圖以sea urchin為例,假設卵子於受精後的反應過程和途徑:

以下的圖是受精的一刻,精子和卵子間的反應的三個假說圖:

b)於sperm fusion前,由精子的接觸到卵子的bindin receptor時,啟動卵子中的Src kinase。

c)於sperm fusion後,由卵子的soluble factor結果於精子上的receptor來啟動。

d)與c圖的差別是soluble factor並非來自卵子,而是來自精子本身的。

        以下的實驗是為了証明卵子於fertilization時,已有一定量的mRNA存在於卵中,以待受精之後,開始分化發育,大量的protein隨之生成。其中實驗中所用到的reagent Actinomycin D, 它是會抑制transcription,所以如果當加有Actinomycin D時,所有的DNA都不會transcription成為RNA的,而於A圖中可以看當加入有Actinomycin D時,於0~5 hr時,仍是有大量的protein,這可表示卵中的細胞質早就存有一定量的mRNA,以準備protein的生成。而於圖中的Y軸是有放射元素的碳14C,當新的protein合成時就需要有C的原料,所以當Y軸升高時,表示有新的protein合成。

        而B圖中Y軸是polysomes, 此即poly-ribosome只會出現在mRNA translate為protein時,所以Y軸的升高即表示正在有新的protein合成,於圖中可以看到於受精卵發育的一開始,polysomes已經出現,亦即已開始在translation。

        於精子的結構是細胞核比centriole更前面, 而centriole於進入卵中後,是會變成centrosome的,為了可以站於精核和卵核之間, centriole進入卵子之後,是會作出180度的旋轉的,變成了於兩核之間, 才變成centrosome來利用microtubules來作出受精後的第一次有絲分裂。

A圖中利用連續照來表現精核旋轉了180度。

B圖中microtubules染成綠色,而細胞核則是染成藍色。於圖中可以見到microtubules是由精核申向卵核的。

        此圖以human為例,而圖中microtubules染成綠色, 而DNA則是染成藍色。A圖中卵子於是於未受精前,剛進行了第一次的meiotic,而排出了一個polar body。B圖是精子剛進去卵子, 由此圖中可見microtubules是和精子一同進來的,而此時卵子亦進行第二次meiotic,再排出了一個polar body。C圖,於受精的15 hr之後,兩核開始靠在一起; 而於圖中的箭頭所指的是精子的尾巴。D圖,受精後的第一次mitotic開始,精核和卵核利用mitotic spindle pole分開。E圖,於prometphase, 精核和卵核排於metaphase equator,開始作mitotic division。於E圖中仍是可以看到精子的尾巴,圖中的箭頭所指就是精子的尾巴。

          以下的圖以青蛙的受精卵為例,來說明rearrangement of the egg cytoplasm。圖A和圖B是受精卵的橫切面示意圖,當精子進入卵子時,dorsal和ventral面都已經決定好了,精子進入的位置日後會發育成為dorsal side,而相對於精子進入的位置日後將會發育成ventral side。而當精子進入卵子後,卵中的cortical cytoplasm會自動向精子進入的位置轉30度,此30度是相對internal cytoplasm而言的; 當cortical cytoplasm轉了30度之後,gray crescent便會出現,此一個位置即是將來gastrulation發生的位置。圖A是青蛙卵子於受精前的狀態,而圖B則是受精後, cortical cytoplasm轉向精子進入轉30度,而出現gray crescent。而圖C和D青蛙受精卵的電顯圖,其中較為深色的地方為pigmental cortical cytoplasm,而顏色較淡的是clear cortical cytoplasm,而圖D更可以看到當受精卵變成2 cells時,是於gray crescent的位置開始分開。

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